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人外周血中分离NK细胞体外扩增及功能检 [复制链接]

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北京知名湿疹医院 https://m-mip.39.net/nk/mip_8814564.html

自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK),是固有免疫细胞中的重要成员,无需抗原预致敏就能破坏靶细胞,且无MHC限制性,应答速度快,在免疫应答的早期即可发挥作用。最近也有研究显示,NK细胞也能展现部分适应性免疫细胞的一些特性。NK细胞表面不表达多态性克隆型受体,如t细胞受体(TCR)或b细胞受体(BCR),它们的细胞杀伤功能的激活主要是由识别靶细胞的受体调控的。从外周血中分离出的静息人NK细胞可以在添加人血清的培养基中,体外存活数天,可用于后续研究受外源刺激后,其表型的改变,及其对下游细胞增殖、杀伤等能力的影响。

图1.NK细胞在肿瘤中的“两幅面孔”

本文整理了从人外周血中分离NK细胞的方法、体外培养条件以及功能检测的相关方法:

实验前准备:

第一部分从人外周血中分离NK细胞

一、PBMC的制备:▲注意:外周血或血沉棕*层不应超过8h。1、将15mlFicoll(Cat:)加至50ml离心管中;2、离心管倾斜30°,将35ml稀释后的血液沿着管壁轻轻铺在离心管中的Ficoll试剂上,避免液体混合;▲注意:用PBS-EDTA缓冲液讲血液体积稀释至2-4倍,血液样本越稀释,PBMC的纯度越好。3、室温20°C,Xg离心30-40min;▲注意:水平离心机,且应缓升缓降,关闭骤停设置。4、小心的从离心机中取出离心管,Ficoll分离液和血浆之间的白膜层,即为PBMC;5、吸弃上清后,将白膜层轻轻地吸出来转移到新的50ml离心管中(多个管中的白膜层可以混在一起)6、用45mlPBS重悬,室温20°C,Xg离心10min,重复操作2次,弃去上清;7、适当的缓冲液重悬,对PBMC进行细胞计数。

二、NK的分选:PBMC制备好以后,采用磁珠分选的方式以达到分离NK的目的,会要用到一些磁珠抗体以及磁力架等产品。具体操作根据自己所需的目的细胞群,购买相关的磁珠产品进行实验即可,都配有非常详尽的产品使用说明书。常见分选产品如下:

图2.NK细胞的常用分选试剂盒汇总

三、NK的流式鉴定:第一次实验操作,建议分选后的细胞,进行NK细胞的活性和纯度的鉴定,避免磁珠操作不当引起的后续实验的不良结果:常规推荐选择死活染料+CD3-CD56+(orNKP46+)的群体。

分选前分选后图3.NK细胞的纯度鉴定

第二部分NK细胞的体外培养

1、重悬0.5-3x10^6个细胞,在含有10%HS(人血清)的LIMDM培养基中(96孔板)。2、用10%HS的IMDM将人IL-15稀释至1g/mL。加入L到步骤1中,即稀释后的人IL-15最终浓度为0.5g/mL。▲注意:此处IL-15为饱和浓度。较低浓度的IL-15或与IL-15其他已知可刺激NK增殖的细胞因子联合刺激均可摸索。如IL-2、IL-15、IL-7、IL-18等单独或组合均能有效地诱导、刺激特定的NK细胞增殖和促进其分化成熟,其中IL-2和IL-15的作用尤为明显。3、将细胞置于37℃的培养箱培养至少48h(可设置用不含IL-15刺激细胞作为对照),再进行后续细胞功能鉴定等实验(表型、外源药物刺激、转染、共培养等操作)。

第三部分NK细胞的功能检测

一、表型鉴定:

图4.NK细胞在不同成熟阶段的圈门策略

二、细胞杀伤能力鉴定:

图5.表征人类NK细胞自然杀伤功能的panel

三、细胞共培养杀伤能力鉴定:1、用GFP,CFSE等带荧光的染料去标记NK的靶细胞;2、将NK细胞与靶细胞的共培养(不同的靶细胞,培养比例梯度和培养时间需要预实验摸索);3、收样后,用CD56流式抗体标记NK细胞,结合绝对计数微球,对靶细胞的数量检测,进行统计分析

图6.细胞*性实验

四、细胞因子分泌能力:使用Elisa单指标检测,或CBA,MSD,Luminex等多因子检测方法,检测NK细胞培基上清的细胞因子表达水平。

图7.NK分泌的细胞因子作用

参考文献:[1]ZottoGD,AntoniniF,PesceS,etal.ComprehensivePhenotypingofHumanPBNKCellsbyFlowCytometry[J].CytometryPartA,,97(9).[2]TrabaJ,WaldmannTA,AntonOM.AnalysisofHumanNaturalKillerCellMetabolism[J].JournalofVisualizedExperiments,().[3]Lal,Kerri,G,etal.OMIP-:Functionalanalysisofhumannaturalkillercells[J].CytometryPartAtheJournaloftheInternationalSocietyforAnalyticalCytology,.[4]AbelAM,ChaoY,ThakarMS,etal.NaturalKillerCellsevelopment,Maturation,andClinicalUtilization[J].FrontiersinImmunology,,9:-.

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