白癜风治疗哪里好 http://pf.39.net/bdfyy/dbfzl/191124/7637171.html白癜风治疗哪里好 http://pf.39.net/bdfyy/dbfzl/191124/7637171.html文献速递｜BS-miRNA-seq技术发现人类microRNA中CpG和非CpG上的(h)m5C修饰
大家好，易基因文献科普栏目又来啦！今天要分享解读一篇发表于RNABiology（IF4.）上的关于人类microRNA中(h)m5C修饰位点检测的文章，本文通过研究作者改良的BS-miRNA-seq技术和MAmBA分析流程获得了人类microRNA上(h)m5C修饰的高分辨率图谱，发现该修饰在人miRNA上广泛分布且不仅限于CpG序列，并通过免疫沉淀实验进一步证实，m5C与hm5C修饰均存在于人类miRNA上。
期刊介绍：
RNABiology(RB)：RB是RNA研究领域的经典杂志和领先期刊，刊登包括转录和剪接、转录后调控基因表达、非编码RNA、RNA定位、RNA翻译、RNA在疾病和治疗等方面的研究文章、简报、综述和评述等。
关于(h)m5C
5-甲基胞苷(5-methyl-Cytosine）和5-羟甲基胞苷(5-hydroxymethyl-Cytosine)是转录组修饰的一种，除了mRNA，在许多非编码RNA(tRNA、rRAN)中也有发现，有研究表明m5C修饰参与调节了这些分子二级结构的稳定。TET酶家族能将m5C转化为hm5C，但在哺乳动物中还未对hm5C进行广泛的研究。
目前检测m5C和hm5C修饰的方法，一是通过亚硫酸盐处理，二是通过能够捕获m5C或hm5C的特异性抗体。亚硫酸盐处理是较为基础的方法，对处理过的分子序列进行测序，能够在单核苷酸分辨率下定量分析甲基化水平，但不能区分m5C和hm5C。基于抗体免疫沉淀的方法允许对每种修饰进行特异性检测，但不能提供关于包含修饰的分子比例的定量结果。
标题：BisulphitemiRNA-seqrevealswidespreadCpGandnon-CpG5-(hydroxy)methyl-CytosineinhumanmicroRNAs
期刊：RNABiology(RB)
影响因子(IF)：4.
发表时间：.6.7
技术平台：BS-miRNA-seq、MAmBA
1、研究目的：
由于存在大量小片段RNA，在一般的BS-RNA-seq数据集中，映射到miRNA的reads极其少量，因此无法全面分析miRNAs中的甲基化修饰。在Cheray等人研究文章里的RNA数据集中，映射到miRNAs的reads百分比也只有大约0.25%。因此，作者开发了一种基于亚硫酸盐处理的高通量NGS策略，以单核苷酸分辨率系统地分析miRNAs中的(h)m5C，即BS-miRNA-seq，和专用的分析流程(BS-miRNA的甲基化评估，MAmBA)，快速检测和分析miRNA中的(h)m5C。
2、项目设计：
2.1样本选取：
培养海拉宫颈癌细胞(HeLaS3)、人肾脏细胞(HEKT)、人外周血单核细胞(PBMC)，从中提取总RNA样本。
2.2项目设计流程图：
3.实验结果
3.1亚硫酸盐microRNA测序方法(BS-miRNA-seq)的建立
本研究通过开发一种优化的亚硫酸盐测序，以单核苷酸分辨率分析人类细胞microRNA上的(h)m5C修饰。由于亚硫酸盐处理会导致RNA片段化，大多数RNA的reads来自tRNA片段，导致miRNAreads的覆盖率非常低，范围在0.%至0.%之间。
通过PAGE纯化的方法，从总RNA中特异性分离miRNA(长度15-35nt)，分离纯化后的RNA进行亚硫酸盐处理和测序，该方法—亚硫酸盐microRNA测序”(BS-miRNA-seq)使测序数据集中映射到miRNA的reads增加了约40倍。
3.2MAmBA：分析miRNA中(h)m5c的生信工具
分析步骤：
(1)对BS-RNA测序数据进行接头处理;
(2)用bowtie2比对tRNA和rRNA数据库，过滤tRNA和rRNA片段;
(3)用tophat2将过滤后的RNA数据与完整的转录组比对;
(4)用bedtools计算所有C位点的覆盖范围和非转换率;
(5)用bisRNA包生成甲基化报告，突出miRNA位点和显著甲基化位点。
MAmBA分析包提供人类(hg38)和小鼠(mm10)基因组，以及为任何物种生成定制MAmBA参考的工具，还包括一个基因组组装(包含匹配的bowtie2指数)、tRNA和rRNA的fasta文件、转录组注释GTF文件(包括miRNA转录本)，和miRBase注释。在一个8核电脑上以最小内存为一个大基因组(如hg38)生成参考序列仅需半个小时。所有脚本和软件均可从
