大家好！今天为大家介绍一篇年发表在ScienceAdvances上的文章，题目为“Cellinvasionindigitalmicrofluidicmicrogelsystems”。该文发展了一种新型的数字微流控（DigitalMicrofluidic,DMF）技术，可操控形成微型水凝胶，用于研究细胞侵袭（CellInvasion）。该平台将两种传统细胞侵袭实验方法的优点加以整合，兼顾高精度三维成像和精准RNA分层测序，深入研究了侵袭过程中特征蛋白的表达差异和相关调控通道，发现多条控制细胞侵袭过程的调节通道。该文章的通讯作者Aaron.R.Wheeler是Toronto大学化学系教授，主要研究领域为数字微流控技术及生物分析新技术，是DMF技术的主要推广者之一，在DMF平台上开发了多种生化分析检测方法。研究背景细胞侵袭实验是研究癌症转移机制的基本实验之一。传统细胞侵袭实验主要分为两种：一种是BoydenChamber方法，其过程为细胞自上而下地穿过多孔膜，进入另一开放的液体培养腔体，该方式的主要优势在于可以方便的对侵袭细胞进行的RNA分析，但是其难以对侵袭外周基质（extracellularmatrix,ECM）的过程中存在的特定状态（如物理突起、黏附过程应力分析、侵袭细胞释放等）进行高精度的成像和动态研究；另一种是基于水凝胶接触的侵袭方法，其主要将侵袭细胞放置于水凝胶边缘，再通过荧光成像的方法对细胞侵袭的ECM过程的监控，并对过程中细胞的各种蛋白表达变化进行分析，但是其缺少了侵袭过程的RNA的分析。为此作者研发了针对细胞侵袭的过程的数字化微凝胶侵袭平台（cellinvasionindigitalmicrofluidicmicrogelsystem,CIMMS），依靠DMF技术的便捷操控形成微型水凝胶，用于研究细胞侵袭。研究内容1.CIMMS平台作者首先表征了该平台上利用DMF系统生成壳层结构的凝胶。如图1所示，DMF驱动胶原I（CollagenI）的原液移动到具有特殊上下双层凹槽的亲水位点，形成亚微升体积的液滴，经过固化后，液滴转化为凝胶存留在位点内。之后驱动含有细胞膜外基质（basementmembraneextract，BEM）的液体经过凝胶位点，液态BEM将胶原I的凝胶包裹在其中。经过再次固化，形成外部BEM-内部胶原I的壳层状水凝胶。当形成壳层结构的凝胶后，DMF操控细胞悬浮液与凝胶一侧接触，并将芯片整体竖直放置，用于模拟重力驱动的垂直方向细胞侵袭实验。相比于传统的平板凝胶实验，CIMMS的凝胶方法有多种优点，如图2所示。首先，由于芯片可以在垂直方向进行侵袭，水平方向荧光成像，在XY平面内可以实现对细胞侵袭的过程进行更高分辨率的成像，克服了传统平板法只能Z轴观测导致空间分辨率不足的缺点。其次，DMF产生的凝胶单元的边缘平整，接触侵袭细胞时可以保证侵袭界面的平整、均一，克服了平板法凝胶因不平整的表面所引起的侵袭细胞分布差异，使得观测者可以更清晰完整地观测到细胞侵袭的距离差异。图1A)细胞侵袭模型。B)CIMMS平台的细胞侵袭模型。C)DMF示意图。D)CIMMS形成壳层结构凝胶的示意图。E)三维重构荧光图展示了凝胶的壳层结构。F)CIMMS形成侵袭模型的示意图。G)平台对侵袭进行荧光成像及凝胶切片RNA测序两种研究。
图2传统平板凝胶法与CIMMS凝胶方法的对比。A-C)平板凝胶法中，凝胶表面的凹凸会导致侵袭细胞的不均匀分布。D-F)CIMMS凝胶方法相比传统平板凝胶法，具有更平整的侵袭表面，可以更好的观测到细胞侵袭的距离差异。
2.高分辨率荧光图像分析与侵袭参数的研究
作者展示了该平台上对凝胶进行高分辨率的荧光图像分析及定量分析细胞侵袭行为的能力。如图3所示，通过对不同细胞系、不同细胞浓度、胶原I的浓度、BEM壳层的厚度等不同条件下侵袭情况的分析，作者对该平台上的细胞侵袭率、侵袭距离、侵袭特异性蛋白的表达差异等侵袭能力的参数进行分析。作者研究了侵袭过程中e型黏附蛋白（e-cadherin）的表达差异，e型黏附蛋的表达量随着侵袭距离的增加而明显下降，并且这一过程在不同构成成分的凝胶中有着明显的差异。如图4所示，作者研究了不同种类的细胞系侵袭能力和相关上调基因。实验结果表明，相对于文献中报道的Arhgf18和BCAM基因的上调所引起的侵袭能力增强，CIMMS平台中没有观测到其导致侵袭能力增加的显著性结果。为此作者提出基因上调的表型不能保证侵袭能力提升的结论。
图3A-C）在不同细胞浓度、胶原浓度、壳层厚度下的细胞侵袭能力的表征。侵袭比例和侵袭距离两种数据更加直观地展示了侵袭过程的相关因素。D-J)绿色e型黏附蛋白的差异化表达，清晰地展示细胞侵袭的过程及不同凝胶结构的侵袭差异。图4乳腺癌不同细胞系侵袭能力的考察。3.CIMMS平台对侵袭过程转录组的分析
该平台的另一个创新点在其实现了凝胶内细胞样品的转录组分层分析。作者使用高精度的凝胶冷冻切片技术，保证了高精度和高准确度地对不同层面的细胞RNA分析。图5中可以看到，通过对不同侵袭深度的细胞进行了RNA分析，研究了内部侵袭细胞和外部非侵袭细胞之间的基因表达差异。作者注意到四种基因（BCL3、CXCL1、CDH1、FRPR1）的差异化表达可以激活ECM过程，并调控侵袭的能力。之后，作者进行了两个细胞通路的分析，并对结果与侵袭能力进行分析（图6）。实验结果表明，DNA损伤和修复通路与侵袭有明显的相关联性。通过无监督学习的分类方法，确认了侵袭性和非侵袭性细胞的几个基因亚群。这些信号通路在之前的文献中没有与侵袭性相关联的报道。因此再次展示了该平台在转录组分析中的优势。
图5侵袭能力存在差异细胞的转录组分析。RNA分析展示了基因通道的上调和荧光图像证实了相关蛋白的表达图6侵袭性和非侵袭性细胞的细胞通路分析内容总结
该文章主要发展了一种新型的细胞侵袭研究平台，将DMF的自动化与高通量的优点充分发挥，并且将两种传统的细胞侵袭分析平台的优点合为一体，不仅对三维凝胶成像的精度提升，而且兼容了RNA精准分层测序，将细胞侵袭过程更全面精准地展现在我们面前。
参考文献1.I.A.Eydelnant,B.B.Li,A.R.Wheeler,Microgelson-demand.Nat.Commun.5,()2.A.Albini,Y.Iwamoto,H.K.Kleinman,G.R.Martin,S.A.Aaronson,J.M.Kozlowski,R.N.McEwan,Arapidinvitroassayforquantitatingtheinvasivepotentialoftumorcells.CancerRes.47,–().3.O.Veiseh,F.M.Kievit,R.G.Ellenbogen,M.Zhang,Cancercellinvasion
reatmentandmonitoringopportunitiesinnanomedicine.Adv.DrugDeliv.Rev.63,–()撰稿人：LXER预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
